转录组分析：limma 差异表达、火山图与热图绘制

2024-01-31 01:58:21

使用 limma 包进行转录组差异表达分析：分步指南

简介

转录组分析是研究基因表达差异的宝贵工具，在生物信息学中扮演着至关重要的角色。差异表达分析识别不同条件下明显不同的基因，为理解生物过程和疾病机制提供了深刻的见解。limma 是 R 语言中用于差异表达分析的强大包，本文将提供一个逐步指南，介绍如何使用 limma 进行转录组数据分析。

数据预处理

在进行差异表达分析之前，我们需要对转录组数据进行预处理：

归一化： 校正技术偏差，如测序深度差异。
过滤低表达基因： 去除表达水平较低的基因，提高分析灵敏度。
转换： 将表达数据转换为对数尺度，以稳定方差并提高正态分布。

差异表达分析

使用 limma 进行差异表达分析包括以下步骤：

设计矩阵： 创建表示不同组的二进制矩阵。
线性模型拟合： 使用 lmFit 函数拟合线性模型，将表达数据作为因变量，组信息作为自变量。
经验贝叶斯收缩： 使用 eBayes 函数收缩模型参数，提高统计检验的稳定性。
差异表达测试： 使用 contrasts.fit 和 eBayes 函数进行成对组比较，生成包含检验统计和 p 值的结果表。

代码示例：

# 导入必要的包
library(limma)

# 创建设计矩阵
design <- model.matrix(~group, data = metadata)

# 拟合线性模型
fit <- lmFit(counts, design)

# 经验贝叶斯收缩
fit <- eBayes(fit)

# 进行差异表达测试
contrast <- makeContrasts(group1 - group2, levels = design)
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast)
fit2 <- eBayes(fit2)

# 提取结果
results <- topTable(fit2, coef = 1, n = 10)

结果可视化

火山图： 一种可视化差异表达基因的方法，将基因的绝对对数倍数变化（|logFC|）绘制在负对数 p 值上。
热图： 显示差异表达基因在不同组中的表达模式，将基因按相似表达模式聚类，并使用颜色表示表达水平。

代码示例：

火山图：

# 使用 ggplot2 绘制火山图
ggplot(results, aes(x = -log10(p.value), y = abs(log2FoldChange))) +
  geom_point(size = 3, alpha = 0.5) +
  labs(x = "-log10(p-value)", y = "Absolute log2 fold change")

热图：

# 使用 pheatmap 绘制热图
pheatmap(as.matrix(results[, c("gene", "log2FoldChange")]),
         cluster_cols = FALSE, cluster_rows = TRUE, show_row_names = FALSE)

结论

使用 limma 包进行转录组差异表达分析是一项复杂但至关重要的任务。通过遵循本指南，研究人员可以利用 limma 的强大功能和直观的可视化工具，获得对基因表达差异的深入理解。

常见问题解答